Tecnología SmartFlareTM, MERCK Millipore

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La detección tradicional de la molécula RNA requiere de una transfección, posteriormente una elaborada serie de pasos para la preparación de la muestra así como la amplificación o detección basada en curvas estándar. Sin embargo el equipo de desarrollo de la compañía MERCK en el año 2014 ganó un premio a innovación debido al trabajo en conjunto de Victor Koong y Don Weldon quienes desarrollaron un sistema de detección para RNA, al cual llamaron SmartFlareTM.

El sistema SmartFlareTM consiste de una sonda que es endocitada por células vivas mediante su maquinaria de endocitosis. Las sondas se incuban toda la noche y la detección se realiza el día siguiente. Con el paso del tiempo las sondas salen de la célula sin efectos adversos (ver Fig 1).

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Fig. 1.- Proceso general de sistema SmartFlareTM

 

Pero ¿cómo está constituida la tecnología SmartFlareTM? Cada sonda consiste de una nano partícula de oro que está conjugada a múltiples copias de oligonucleótidos de doble cadena; una de estas cadenas corresponde a la cadena reportero, la cual lleva un fluoróforo que no libera su fluorescencia debido a su cercanía con la partícula de oro. Cuando la sonda se pone en contacto con el blanco de RNA, el RNA se une a su cadena complementaria de captura y desplaza a la cadena reportero, liberando así la fluorescencia, la cual puede ser detectada por diversas plataformas de detección  como microscopia confocal ó citometría de flujo (ver Fig 2).

Imagen 2 

Fig 2.- Mecanismo molecular de la sonda de detección de RNA SmartFlareTM.

En muchas ocasiones, en el área de investigación nos hemos encontrado con diversos problemas; en muchos de los casos no existen buenos anticuerpos para la molécula que deseamos analizar (marcadores de superficie), no existen anticuerpos (por ejemplo para los micro RNA), no hay forma de etiquetar a la célula debido a que la molécula a analizar son biomarcadores secretados ó simplemente no los podemos ver en células vivas (biomarcadores intracelulares). Sin embargo gracias al descubrimiento de la tecnología SmartFlareTM estos problemas pueden resolverse. El sistema de detección para RNA SmartFlareTM provee diversas ventajas:

  1. a) La detección del RNA se realiza sin necesidad de preparar una muestra, debido a que la sonda se une de manera directa al RNA y puede medirse dentro de células individuales (eliminando la necesidad de amplificación y la lisis celular).
  2. b) Se puede detectar el RNA sin efectuar una transfección, existen diversos métodos para la detección de RNA que requieren alterar la expresión de genes o posiblemente perturbar alguna cascada de señalización ó el metabolismo celular. El sistema Smartflare es simple y no ocasiona efectos adversos, ya que al acoplar un dúplex de oligonucleótidos (cadena reportero y cadena de captura) a nano partículas de oro, estas son endocitadas por la maquinaria de endocitosis de la célula. Dicho proceso solo requiere incubar el cultivo con la sonda especifica toda una noche y al día siguiente llevar a cabo la detección de la fluorescencia. Las sondas con el paso del tiempo son eliminadas de la célula.
  3. C) Sondas específicas, cada una de ellas está diseñada para liberar la fluorescencia únicamente cuando la sonda de captura ha encontrado su blanco y la sonda que lleva el fluoróforo se desacopla del dúplex.
  4. D) Viabilidad, el equipo de desarrollo de EMD millipore se ha asegurado de que la incubación de las sondas SmartFlareTM con las células no genere efectos celulares adversos y tampoco compromete su viabilidad celular.
  5. E) Plataforma de detección y tipos de fluoróforos, las sondas SmartFlareTM están conjugadas con los fluoróforos 3-Cianina y 5-Cianina, los cuales pueden ser detectados en una amplia variedad de plataformas de detección entre las que encontramos a la citometría de flujo y la microscopia confocal.

A la fecha diversas moléculas han sido estudiadas a través del sistema SmartFlareTM como la cuantificación de la regulación positiva del mensajero de interleucina 6 debido a un estímulo inflamatorio en una línea celular de monocitos. El nivel de expresión del mensajero de survivina debido a un knockdown en células escamosas humanas de carcinoma (SCC12) y células humanas de adenocarcinoma de próstata (LNCaP). En el estudio de la expresión de genes pluripotentes en células embrionarias y en células madre pluripotentes inducidas de diferentes especies. En el monitoreo de los niveles de expresión del morfógeno embrionario Nodal, el cual se expresa a altos niveles en melanomas agresivos.

Actualmente el área de ciencias de la vida de la compañía Merck ofrece una gama de sondas SmartFlareTM que pueden ser herramientas útiles en diversas áreas de investigación como en la citometría de flujo, la selección de células vivas (sorting), la detección de microRNAs, la interacción de RNA-proteína, en la modulación de genes mediados por SiRNA/RNAi  y las imágenes de células que nos permitan la visualización de la morfología y niveles de expresión de proteínas en células vivas. A partir de este año usted podrá acceder a estos productos a través de METRIX LABORATORIOS.

Referencias

A Smart solution to RNA Detection, R&D

Detection of siRNA-mediated gene modulation using SmartFlareTM detection probes

Measurement of IL-6 RNA levels in live cells using SmartFlareTM technology with the ImageStreamX Mark II Imaging flow cytometer

It´s what´s on the inside that matters. Detect internal biomarkers in live cells.

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