PCR en Tiempo Real

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Al último grito de la moda… Y la tecnología

Consideraciones del PCR en tiempo real

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Desde su introducción al mercado hace más de 16 años, los termocicladores en tiempo real se han convertido en la técnica principal para la detección de ácidos nucleicos, tanto en investigación y desarrollo, como en la rutina diaria.

La técnica de PCR fue desarrollada en 1983, un descubrimiento tan simple y brillante, que le dio a Kary Mullis el premio Nobel en Química 10 años después. Basándose en la habilidad natural de las polimerasas de copiar ácidos nucleicos en la presencia de oligonucleótidos complementarios, Mullis sugirió que al utilizar una polimerasa termoestable, la reacción podría ser automatizada para realizar múltiples copias al programar la temperatura de forma cíclica. Con cada uno de los ciclos la cadena de DNA se duplica hasta que uno de los reactivos se limita y la reacción termina, para dar lugar al análisis por medio de la electroforesis.

Muchos de los grandes descubrimientos de la historia ocurren a raíz de un accidente, y el PCR en tiempo real no fue la excepción; cuando Bob Griffith y Russell Highuchi corrieron, accidentalmente, un PCR en presencia de bromuro de etidio, descubrieron que la reacción no se inhibía y por tal motivo debería ser posible monitorear la amplificación en tiempo real mediante una tinción en fluorescencia.

Claro que desde entonces esta práctica se ha modificado y ha ido mejorando, pero el PCR en tiempo real ha ido ganando mucha popularidad, al ser una técnica cuantitativa, pues a la vez que amplifica, permite cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación de ADN.

Uno de los problemas más comúnmente reportados al utilizar este método es la contaminación por acarreo; la cual puede ser prevenida con adecuadas técnicas de laboratorio, ya que no es un problema de los termocicladores en sí.

Los Aerosoles que se crean cuando los tubos son abiertos, pueden contaminar otras muestras con el ácido nucleico incorrecto, dando como resultado falsos- positivos. Por lo que se recomienda que los laboratorios tengan áreas separadas para las diferentes etapas del proceso de PCR, es decir, lugares dedicados para la preparación, ciclo y análisis; de esta forma cada equipo permanece en una ubicación específica y disminuye el riesgo de contaminación, claro que los técnicos deben cambiar de guantes y bata al cambiar de área.

Otro método para evitar la contaminación es exponer la reacción a la luz ultravioleta o utilizar radiación gamma para desactivar cualquier producto resultado del acarreo; incluso algunos fabricantes incluyen agregar enzimas especiales en el protocolo, para borrar cualquier sobra que haya quedado de algún ensayo anterior.

Ciertas características de los termocicladores en tiempo real y final tienen un efecto significativo en el rendimiento del instrumento y el éxito de reacción, por lo que hay que elegir bien cuál adquirir. El tiempo total de la reacción es muy importante para determinar el rendimiento de un equipo, al igual que la uniformidad de la temperatura. Si el protocolo nos marca un minuto a 95⁰C, el minuto no debe empezarse a contar hasta que todas las muestras en el bloque estén a esa temperatura, por lo que esta debe medirse en la muestra, no en el bloque, además que las muestras tardan un periodo de tiempo en alcanzar la misma temperatura que su recipiente.

Si las reacciones van a llevarse a cabo durante la noche, la cantidad de tiempo que un dispositivo puede almacenar las muestras a una temperatura específica se convierte en una característica importante.

Es recomendable que el equipo cuente con el elemento calentador en la tapa, lo cual garantiza homogeneidad de temperatura y evita la evaporación, por lo que no es necesario agregar aceite a las muestras.

El hecho de que el equipo cuente con memoria para almacenar los protocolos puede reducir mucho tiempo a la hora de programar y debe contar con interface a impresora y/o computadora para poder transferir y analizar los datos.

Por último es muy importante que su proveedor local cuente con un departamento de servicio técnico, ya que de lo contrario será necesario enviar el equipo con el fabricante, generando gastos adicionales no contemplados.

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