No es el calor, es la humedad

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Las micropipetas funcionan extremadamente bien en ambientes húmedos.

Por: Rumery, D; Carle, B.

Entender como las micropipetas funcionan en ambientes con altos niveles de humedad, es crítico para la integridad de los datos. Los niveles de humedad pueden variar entre laboratorios, e incluso llegan a cambiar en diferentes áreas del mismo laboratorio. Adicionalmente, de acuerdo a los estándares regulatorios, los laboratorios de calibración de micropipetas deben controlar la humedad relativa a más del 50%, mientras que cualquier laboratorio es normalmente mucho más seco.

Un equipo de expertos de la empresa Artel, visitaron el Parque Olímpico Nacional en Washington para determinar cómo es que las micropipetas se comportan en ambientes húmedos y si la variación en los niveles de humedad afecta la precisión y exactitud del pipeteo.

Definiendo el potencial de evaporación

Antes de probar el efecto de la humedad en el pipeteo, se evaluó la relación entre humedad y temperatura. Un estudio anterior ya había demostrado que es difícil separar la temperatura y la humedad cuando se analiza el desempeño de una micropipeta.

Está claro que pipetear en ambientes secos causa evaporación dentro de la punta, lo que generará que se dispense menos volumen del nominal, sobretodo en soluciones acuosas. En un ambiente con una humedad relativa constante, la evaporación ocurre en mayor medida, en temperaturas cálidas que en frías. La velocidad de evaporación es proporcional a una fuerza termodinámica llamada Potencial de Evaporación, que es definida como la diferencia entre la presión parcial del agua en el aire (Pw) a una condición saturada (100% de humedad relativa), y la presión parcial del agua en el aire real en condiciones ambiente. Entender el potencial de evaporación en el laboratorio es el primer paso al estudiar como las condiciones de humedad afectan los volúmenes pipeteados.

Para determinar el potencial de evaporación de un lugar, se pueden utilizar cualquiera de las siguientes ecuaciones:

  1. Potencial de evaporación = Pw, saturada – Pw, ambiente
  2. Potencial de evaporación = Pw, saturada x (1 – Humedad relativa)

La presión parcial del agua en el aire (Pw) en condiciones de saturación, depende casi totalmente de la temperatura. Mientras la temperatura incrementa, la cantidad de agua que puede contenerse en el aire también incrementa. Si la humedad relativa se mantiene constante, aumentar la temperatura incrementa el potencial y la velocidad de evaporación dentro de la micropipeta. Por otro lado, si la temperatura se mantiene constante, aumentar la humedad relativa, disminuye el potencial de evaporación. Esto es lo que ocurre en la mayoría de los laboratorios de calibración, la temperatura se mantiene constante a 20°C y la humedad relativa se incrementa para disminuir la velocidad de evaporación y mejorar el desempeño de la pipeta.

El experimento

Para estudiar el desempeño del pipeteo en un ambiente de alta humedad y bajo potencial de evaporación, Artel buscó una ubicación templada y húmeda. El parque Olímpico Nacional tiene estas condiciones a finales del verano, principios de otoño, por lo que el experimento se llevó a cabo en esas fechas.
Al llegar, era rápidamente evidente que la temperatura estaba inusualmente fría, 6°C menos que la temperatura habitual; sin embargo se decidió llevar a cabo las pruebas, ya que la temperatura era de 14°C y la humedad relativa de 74%, lo que daba un potencial de evaporación de sólo 4.5 milibares.

El desempeño del pipeteo fue probado en el campo, utilizando el sistema de calibración Artel PCS®, que al estar basado en fotometría, se vuelve un sistema portátil y el resultado no se afecta por las condiciones climáticas. El PCS fue utilizado para medir volúmenes dispensados por pipetas de 2, 20, 200 y 1000µl. El sistema comparó automáticamente el volumen real dispensado contra el deseado y cuantificó el error resultante.

Se encontró que en ambientes muy húmedos las pipetas se desempeñaron extremadamente bien; en la siguiente tabla se muestran las pipetas que dispensaron el volumen de forma exacta, con un porcentaje de inexactitud de sólo -0.35%; siendo -1.55% la inexactitud más grande reportada.

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La siguiente tabla muestra que las micropipetas también se desempeñaron de forma consistente en la playa Rialto (dentro del Parque Olímpico Nacional), con todas menos una pipeta que reportó resultados de imprecisión (CV) muy cercanos a las especificaciones de la pipeta.

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Después de regresar de la Playa Rialto, los investigadores notaron que en su hotel (Olympic Inn), la humedad relativa era de exactamente 60% y la temperatura 20°C, las especificaciones regulatorias para un laboratorio de calibración. Después de probar las pipetas en esa ubicación, se encontró que estas se desempeñaban muy bien también, como era de esperarse. La inexactitud promedio fue de -0.11% y la imprecisión 0.68.

Las micropipetas se desempeñaron de forma similar en el Olympic Inn y en el laboratorio controlado de Artel porque ambos tienen casi el mismo potencial de evaporación. El potencial de evaporación fue de 10mbar en el laboratorio, y 9.4mbar en el hotel.

Desempeño de las micropipetas en un laboratorio común

Mientras parecía que Artel había encontrado el ambiente perfecto para un desempeño exacto y preciso, los laboratorios comunes normalmente no tienen niveles de humedad tan altos como en el Parque Olímpico; lo más común es encontrar humedad relativa de 15-40%. Para determinar si las pipetas se comportaban diferente en un laboratorio común que en uno húmedo, se probaron las micropipetas en ambientes con diferentes grados de potencial de evaporación.

Primero, se probaron las pipetas en el laboratorio A con condiciones más secas a 22% de humedad relativa y 21°C; y también se probaron en el laboratorio B con condiciones más húmedas 40% de humedad relativa y 22°C.

El laboratorio B tenía un potencial de evaporación de 16mbar, el promedio de inexactitud fue de 0.05% y la imprecisión de 0.73, lo que indica que el desempeño de las pipetas es bueno. En el laboratorio A, con un potencial de evaporación de 20.6mbar, la inexactitud promedio fue de             -1.55% y una imprecisión de 7.10, ambos errores estadísticamente significativos. Los datos muestran que laboratorios más secos son más propensos a los errores en pipeteo; también se concluye que hay un desempeño significativamente menor en el pipeteo en ambientes con niveles de humedad de 20% versus 60%.

Los datos aparecen en las tablas que se muestran más arriba, en donde se puede apreciar que cuando mayor es el potencial de evaporación es más probable encontrar inexactitud e imprecisión.

¿Qué significa esto?

En experimentos anteriores se demostró que el calor causa que se dosifique un volumen menor al especificado debido a la evaporación; cuando se pipetean soluciones acuosas la evaporación ocurre dentro de la punta, con la primera aspiración y por tal se dosifica menos volumen. Con el tiempo, mientras la micropipeta está expuesta continuamente al líquido pipeteado, la punta se humidifica, causando que el volumen se incremente con cada dosificación, generando imprecisión y variabilidad en los datos.

En viceversa, en ambientes húmedos y fríos, el potencial de evaporación es mínimo. Cuando se pipetea, el instrumento está constantemente humedecido, resultando en muy poca o nula evaporación. Sin evaporación, el volumen dispensado es más consistente y exacto. El pipeteo se convierte en un proceso más estable y repetible.

Los laboratorios con condiciones cambiantes son más propensos a los errores de pipeteo causados por la falta de humedad. En primer lugar, los laboratorios con ambientes secos y cálidos pueden experimentar una dosificación menor a la deseada; y aquellos que tienen variaciones en la humedad durante el año, también experimentan variabilidad en el pipeteo. Por último, las pipetas calibradas en laboratorios de calibración, es más probable que trabajen fuera de especificación en laboratorios con altas temperaturas y bajos valores de humedad relativa.

Muchas cosas pueden hacerse para evitar el riesgo de error en el pipeteo causado por la variación en humedad. Primero, probar el desempeño del instrumento en el ambiente exacto donde se va a utilizar puede ayudar a eliminar la humedad como fuente de error. Esta práctica proveerá de información sobre el desempeño real, por lo que se pueden ajustar los procesos de pipeteo en base a eso.

Segundo, es altamente recomendado pre humectar la punta previo a sus uso, esto es aspirar y soltar el líquido dos o tres veces antes de la dosificación, esto mejorará el desempeño general, reducirá el riesgo de evaporación y ofrecerá dispensaciones más consistentes.

 

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